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摘 要： 鞘翅目害蟲是目前檔案庫(kù)房中最常見(jiàn)的有害生物之一，害蟲嚴(yán)重爆發(fā)時(shí)，被蛀食的檔案紙張被大面積毀損且無(wú)法修復(fù)，所以檔案蟲情監(jiān)測(cè)和預(yù)防極為重要。由于庫(kù)房中害蟲成蟲采集難度大、害蟲形態(tài)蟲態(tài)差別大、發(fā)生規(guī)律各異、專業(yè)人員緊缺等原因，檔案庫(kù)房鞘翅目害蟲的快速準(zhǔn)確鑒定成為一個(gè)難點(diǎn)，為了更好地解決這個(gè)問(wèn)題，本次研究我們利用DNA條形碼鑒定技術(shù)將采集到的樣本進(jìn)行分子鑒定，利用線粒體基因組的COI基因片段，建立了檔案鞘翅目害蟲DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)。除此之外，本次研究中利用分子數(shù)據(jù)將3種害蟲的成、幼蟲配對(duì)，為解決幼蟲形態(tài)鑒定困難的問(wèn)題提供了新的思路。最后，我們討論了如何更好地結(jié)合形態(tài)數(shù)據(jù)和DNA條形碼數(shù)據(jù)進(jìn)行物種鑒定，說(shuō)明了DNA條形碼技術(shù)能利用最少的取樣實(shí)現(xiàn)快速高效鑒定檔案鞘翅目害蟲常見(jiàn)種類各蟲態(tài)樣本的目標(biāo)。
關(guān)鍵詞：檔案害蟲；DNA條形碼；COI基因
DNA Barcoding Identification of Archives Coleoptera Pests
Abstract: Coleopteran are one of the most common pests in the archive rooms. In the case of serious pest outbreaks, the archival papers eaten by pests are irreparably damaged,so it is really important to monitor the situation and prevent the burst of pests in archives. The rapid and accurate identification of coleopteran pests has become a hard case due to the difficulty of collecting pests, the obvious individual differences, the disordered occurrence rules, and the shortage of professional taxonomist. In order to solve this problem, we used DNA barcoding technology to identify the archival pest samples based on the mitochondrial COI gene. Finally we established the archival coleopteran pest DNA barcode database including 9 coleoperan species and 4 other pests. Beyond that, this study found 3 pairings between adult and larva, which may provide a new way to solve the problem of identifying larva. At the work report of this study,we discussed how to better combine morphological data and DNA barcode data to identity species, we illustrated that DNA barcoding technology is a qualified method that can help researchers to identify archival coleopteran pests.
Key words: archival pests, DNA barcoding, COI gene
檔案害蟲屬于倉(cāng)儲(chǔ)物害蟲的一部分，目前我國(guó)有記載的倉(cāng)儲(chǔ)物害蟲約500種[1]，其中危害檔案的害蟲已發(fā)現(xiàn)71種。檔案害蟲分屬于6目21科，其中鞘翅目昆蟲共50種，是最常見(jiàn)的也是危害最嚴(yán)重的檔案庫(kù)房害蟲[2] [3]。鞘翅目害蟲多以蛀孔的方式對(duì)紙質(zhì)檔案造成破壞，受害嚴(yán)重的檔案紙張被大面積損毀，無(wú)法補(bǔ)救，也會(huì)給國(guó)家檔案保護(hù)和文化遺產(chǎn)保護(hù)工作造成嚴(yán)重的影響，因此對(duì)鞘翅目檔案害蟲的預(yù)防與治理工作是非常重要的。
種類準(zhǔn)確識(shí)別鑒定是害蟲防治的基礎(chǔ)，鞘翅目昆蟲已知物種數(shù)量近四十萬(wàn)，其分類鑒定工作以成蟲形態(tài)研究為主，幼蟲形態(tài)相似度高，較難鑒定。由于形態(tài)研究對(duì)鑒定人員的分類知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)要求較高，對(duì)害蟲標(biāo)本的保存情況要求也較高，實(shí)際工作中種類鑒定困難較大。近年來(lái)，快速發(fā)展的分子生物學(xué)技術(shù)為昆蟲種類的快速高效鑒定提供了新的方法，其中DNA條形碼分子鑒定技術(shù)是物種鑒定最有效的方法之一[4] [5]，成熟的DNA條形碼鑒定體系可以實(shí)現(xiàn)不同蟲態(tài)、蟲尸、碎片的快速準(zhǔn)確物種鑒定[6] 。然而，檔案害蟲分子生物學(xué)研究仍處于初級(jí)階段，且目前的倉(cāng)儲(chǔ)物害蟲分子研究多集中于儲(chǔ)糧害蟲和煙草制品害蟲[7] ，如危害儲(chǔ)糧安全的擬步甲科[8] 、皮蠹科[9] [10]害蟲等，并沒(méi)有針對(duì)檔案害蟲的DNA條形碼鑒定研究。
因此，本次開(kāi)展鞘翅目檔案害蟲DNA條形碼研究，首先是為了填補(bǔ)檔案保護(hù)工作中害蟲分子鑒定技術(shù)的空白，有效的彌補(bǔ)傳統(tǒng)形態(tài)分類鑒定方法的短板，提高鑒定的準(zhǔn)確度和效率。同時(shí)，研究成果可以為其他行業(yè)生物分子鑒定研究提供理論和技術(shù)參考。
DNA序列由A、T、G、C四種堿基組成，如果有n個(gè)堿基，就會(huì)有4n種編碼方式。按照這個(gè)公式計(jì)算，15個(gè)堿基位點(diǎn)就能出現(xiàn)近10億種的編碼序列，這個(gè)數(shù)字是現(xiàn)存物種的100倍，再考慮到在蛋白編碼基因中密碼子的簡(jiǎn)并性，那么也只需要有45個(gè)堿基位點(diǎn)，就可以獲得近10億個(gè)DNA序列。由此看來(lái)，DNA條形碼可以建立在一段長(zhǎng)度為幾百個(gè)堿基的基因序列信息的基礎(chǔ)之上，從理論上來(lái)講完全可以包括所有物種。這為DNA條形碼分類工作的可實(shí)現(xiàn)性提供了條件，但是生物的基因組往往含有數(shù)萬(wàn)個(gè)甚至數(shù)十萬(wàn)個(gè)堿基位點(diǎn)，所以選擇哪一部分基因作為標(biāo)記就成為了另一個(gè)問(wèn)題。理想的DNA條形碼應(yīng)該符合以下幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：(1)在種間有明顯的遺傳變異和分化，同時(shí)種內(nèi)變異足夠??；(2)片段足夠短，便于完成測(cè)序工作，而且便于DNA提取和PCR擴(kuò)增，尤其是對(duì)存在DNA降解的材料(如：保存已久的浸泡標(biāo)本、處理過(guò)的民間藥材)；(3)存在保守區(qū)域，便于設(shè)計(jì)通用引物。也就是說(shuō)這樣的標(biāo)記既要有一點(diǎn)的保守性又要有一定的變異性，片段的長(zhǎng)度也要適中，而且還需要考慮到假基因和基因插入或缺失的情況（見(jiàn)下文）。從目前的研究結(jié)果來(lái)看，動(dòng)物的DNA條形碼標(biāo)記選擇趨向于COI基因，原核生物的標(biāo)記則趨向于16S rRNA基因，對(duì)植物而言，人們提出過(guò)以rbcLa基因和matK基因作為標(biāo)記，但是都受到了爭(zhēng)議 [11]，真菌界條形碼基因的選擇則仍在探尋階段[12]。
盡管存在很多懷疑和反對(duì)，DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展依舊迅速，至2021年底，生命條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)已經(jīng)有超過(guò)一千萬(wàn)個(gè)DNA條形碼數(shù)據(jù)。生命條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)中的絕大多數(shù)條形碼來(lái)自動(dòng)物（超過(guò)230萬(wàn)個(gè)物種的數(shù)據(jù)），其次是植物（約7萬(wàn)種植物為rbcL序列）和真菌（2萬(wàn)4千多物種為ITS序列），而多種多樣的單細(xì)胞原核生物仍然有很多未被發(fā)掘。
2.1 實(shí)驗(yàn)思路
（1）研究樣本選取與標(biāo)本收集
基于“全國(guó)檔案害蟲種類及分布調(diào)查”項(xiàng)目的調(diào)研結(jié)果以及目前的標(biāo)本積累情況和文獻(xiàn)資料調(diào)研，確定本研究所選取的鞘翅目檔案害蟲種類。根據(jù)研究需要制定標(biāo)本采集計(jì)劃并開(kāi)展標(biāo)本收集工作。研究材料主要基于目前已有的館藏標(biāo)本及飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)昆蟲，并通過(guò)利用粘蟲板等昆蟲采集方法，補(bǔ)充收集用于DNA條形碼研究的新鮮標(biāo)本。同時(shí)，向其他開(kāi)展倉(cāng)儲(chǔ)物害蟲研究的單位借用定名標(biāo)本，補(bǔ)充標(biāo)本采集空白。
（2）形態(tài)分類鑒定
利用形態(tài)分類方法進(jìn)行物種鑒定，除根據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行鑒定外，盡可能核對(duì)模式或定名標(biāo)本，完成成蟲拍照及其圖片處理。
（3）DNA提取和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴(kuò)增方案制定
通過(guò)對(duì)標(biāo)本的預(yù)處理試驗(yàn)和對(duì)DNA提取實(shí)驗(yàn)步驟的優(yōu)化，制定鞘翅目檔案害蟲DNA提取的具體方案，確保DNA提取的有效濃度和純度；
通過(guò)對(duì)PCR體系的優(yōu)化和PCR程序的調(diào)試確定該類群DNA條形碼的最適PCR條件；
在最優(yōu)的DNA提取和PCR擴(kuò)增方案基礎(chǔ)上，對(duì)所有采樣進(jìn)行DNA模板的提取和條形碼片段的擴(kuò)增。
（4）篩選最適DNA條形碼標(biāo)記
根據(jù)已有的檔案庫(kù)房鞘翅目害蟲名錄，從國(guó)際通用數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢相關(guān)DNA條形碼數(shù)據(jù)，基于對(duì)COI、28S、18SrRNA三種常見(jiàn)基因分子標(biāo)記的國(guó)際通用引物的修飾改進(jìn)，確定不同分子標(biāo)記引物的擴(kuò)增效率，調(diào)查最適用于鞘翅目檔案害蟲的DNA條形碼分子標(biāo)記。
（5）檔案鞘翅目害蟲種間遺傳距離估算
整理匯總查詢的DNA條形碼數(shù)據(jù)和本項(xiàng)目補(bǔ)充的條形碼數(shù)據(jù)，估算檔案庫(kù)房鞘翅目害蟲DNA條形碼片段的種間遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離，確定種間遺傳距離足夠作為分子鑒定依據(jù)。
（6）基于分子數(shù)據(jù)的系統(tǒng)發(fā)育分析
利用篩選出的最適DNA條形碼分子標(biāo)記，可采用最大簡(jiǎn)約法，最大似然法，或者鄰接法三種方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
（7）DNA條形碼體系的建立
基于下載的與檔案庫(kù)房鞘翅目害蟲近緣類群的DNA條形碼數(shù)據(jù)，以及本研究室采集到的DNA條形碼數(shù)據(jù)，分析物種間和物種內(nèi)的遺傳距離差異，確保DNA條形碼對(duì)物種界定的有效性，利用系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)、barcoding gap分析，對(duì)篩選出的最適宜分子標(biāo)記進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，判斷其作為DNA條形碼的有效性，確定其可否達(dá)到物種鑒定目的。
本試驗(yàn)所收集的標(biāo)本信息見(jiàn)表1。所有樣本采集后保存在95%的酒精中，-10℃保存?zhèn)溆谩?/span>
主要實(shí)驗(yàn)儀器包括：離心機(jī)，恒溫水浴鍋，PCR儀，水平式電泳槽，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，紫外凝膠成像儀，組織研磨器。
主要化學(xué)試劑包括：血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）、微量樣品基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）、Taq Plus DNA Polymerase(500,2.5U/μL)、2×Taq PCR MasterMix II(帶核酸染劑)、蛋白酶K、2.5mM dNTPs、10×Taq 緩沖液、6×DNA上樣緩沖液、Gold View核酸染料、瓊脂糖、D2000 DNA Maker、引物。
使用“血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）”進(jìn)行基因組DNA的提取，具體操作參考試劑盒說(shuō)明書。樣品預(yù)處理步驟為：取液浸（無(wú)水乙醇）標(biāo)本，成蟲取整個(gè)胸部，幼蟲去掉頭部取剩余部位，單頭樣本放入2ml離心管中。對(duì)于較小的樣品，可取2~3頭，放入離心管后用組織研磨器研磨粉碎。
對(duì)保存時(shí)間超過(guò)半年、蟲態(tài)為幼蟲、單頭標(biāo)本體長(zhǎng)不超過(guò)2mm的樣本，使用天“微量樣品基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）”進(jìn)行基因組DNA的提取，具體操作參考試劑盒說(shuō)明書。樣品預(yù)處理步驟為：取液浸（無(wú)水乙醇）標(biāo)本，晾干酒精，體長(zhǎng)超過(guò)2mm的成蟲取整個(gè)胸部，幼蟲去掉頭部取剩余部位，單頭樣本放入2ml離心管中。對(duì)于較小的樣品，可取2-3頭，放入離心管后用組織研磨器研磨粉碎。
PCR反應(yīng)的擴(kuò)增體系為25μl，其中包括去離子水 14.5μl、10×Taq 緩沖液 5.0μl、2.5mM dNTPs 2.0μl、上游引物1.0μl、下游引物1.0μl、DNA模板1.0μl、2.5U/μl的Taq聚合酶0.5μl。
如果使用2×Taq PCR MasterMix II(帶核酸染劑)，則25μl體系為：2×Taq PCR MasterMix II 13.0μl、ddH2O 9.0μl、上游引物1.0μl、下游引物1.0μl、DNA模板1.0μl。
PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性1分鐘（模板裂解嚴(yán)重的縮短為30秒），94℃變性30秒（模板裂解嚴(yán)重的縮短為10秒）、43℃退火45秒（退火溫度因引物而異，此處為COI基因片段退火溫度，核基因片段一般為48℃或更高）、65℃延伸1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后65℃延伸10分鐘后，5℃保存。
取5μl 6×DNA 上樣緩沖液，與擴(kuò)增的樣品基因組DNA原液混勻，上樣于1.5%瓊脂糖凝膠中（如果使用Taq PCR MasterMix為擴(kuò)增體系，則直接從擴(kuò)增產(chǎn)物原液中取5μl上樣），以1×TAE為電泳緩沖液，以D2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)作為分子量的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，在220V穩(wěn)定電壓下電泳約20min，直至指示劑距低端約1cm。在紫外凝膠成像儀下觀察檢測(cè)提取的DNA片段的質(zhì)量。
經(jīng)電泳檢驗(yàn)合格的PCR產(chǎn)物交由生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。使用Conting Express1軟件檢查測(cè)序峰圖，并將每個(gè)樣品的正反向序列進(jìn)行拼接，得到的片段保存為fasta格式文件。將所得序列與NCBI中已經(jīng)登記的基因片段進(jìn)行BLAST相似性比對(duì)，初步判斷確定擴(kuò)增產(chǎn)物的可靠性。
種間遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離之間存在一個(gè)明顯的差異，我們將這個(gè)差異稱為DNA barcoding gap，這是DNA條碼分析的一個(gè)重要部分。如果一個(gè)類群序列間存在著明顯的barcoding gap，表示其種內(nèi)的遺傳距離明顯小于種間遺傳距離，那么它們就很容易被區(qū)分。相反，如果只有一個(gè)很小的或不存在DNA barcoding gap，那么這個(gè)類群的條形碼物種界定就不清晰，利用DNA條形碼去識(shí)別物種時(shí)就有一定困難。為了檢驗(yàn)樣本種間與種內(nèi)個(gè)體間遺傳變異的差異是否顯著，我們使用MEGA X軟件以K-2P模型計(jì)算COI基因片段的種內(nèi)及種間遺傳距離并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)頻率分布，進(jìn)行barcoding gap分析。本項(xiàng)目中我們收集到了7科9屬9種13個(gè)樣本的鞘翅目害蟲，利用這13個(gè)樣本的COI基因片段和目前已發(fā)表的同屬物種的COI基因片段（薪甲因未鑒定到物種，選擇兩個(gè)有記錄的屬），以屬（或科）為單位，做了9個(gè)barcoding gap分析。
在數(shù)據(jù)的整理中，我們規(guī)定納入分析的條形碼數(shù)據(jù)要滿足以下條件：保證所有條形碼的同源性，因?yàn)榘l(fā)表的COI數(shù)據(jù)同源性并不統(tǒng)一，有的為該基因的前半段而有的為后半段，我們自己測(cè)序了COI基因的全長(zhǎng)序列，可根據(jù)需要?jiǎng)h減部分片段和序列；COI片段長(zhǎng)度大于500bp[為了能夠計(jì)算該種的種內(nèi)遺傳距離差異，鋸谷盜屬（Oryzaephilus）屬中大眼鋸谷盜（O.mercator）保留了3條500bp以下的數(shù)據(jù)]；排除未鑒定到屬的序列，即物種為某科的sp.的序列不在數(shù)據(jù)集中。
根據(jù)MEGA X中Distance模塊的分析，將510條符合條件的數(shù)據(jù)根據(jù)科或者屬分類（510條數(shù)據(jù)包括本實(shí)驗(yàn)測(cè)序的18條序列及數(shù)據(jù)庫(kù)下載的492條序列，下載數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)索引編碼和分類信息詳見(jiàn)附錄），整理為9個(gè)組，每個(gè)組內(nèi)計(jì)算出樣本的種間遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離[除薪甲科（Latridiidae）之外，每個(gè)組中包括本次采集樣本的同屬物種的COI序列]。結(jié)果表明平均種內(nèi)遺傳距離為0.018（最大為0.053，最小為0），平均種間遺傳距離為0.215（最大為0.333，最小為0.106），超過(guò)種間遺傳距離11.9倍（表2）。依據(jù)Hebert等提出的利用COI序列進(jìn)行物種鑒定的前提，種間遺傳距離大于種內(nèi)遺傳距離差異，且一般種內(nèi)遺傳差異在2%以內(nèi)，種間遺傳差異至少是種內(nèi)遺傳差異的10倍[16] ，在理論上可以利用COI基因條形碼對(duì)檔案鞘翅目害蟲進(jìn)行初步鑒定，但是我們?cè)卺槍?duì)每個(gè)物種的單獨(dú)分析中，也發(fā)現(xiàn)了僅用COI片段條形碼進(jìn)行物種界定時(shí)存在的問(wèn)題（圖1）。
圖1 分組的種間、種內(nèi)遺傳距離比較
以遺傳距離的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)直觀地看DNA barcoding gap，從圖1中我們發(fā)現(xiàn)擬裸蛛甲、檔案竊蠹、煙草甲、黑毛皮蠹、薪甲及鋸谷盜都有明顯的barcoding gap存在，但是花斑皮蠹、光肩星天牛和赤擬谷盜的種間遺傳距離與種內(nèi)遺傳距離差異并不大，DNA barcoding gap不存在或不明顯。因此我們以屬為單位統(tǒng)計(jì)每個(gè)種的條形碼數(shù)據(jù)的兩兩遺傳距離差，比較種間遺傳距離與種內(nèi)遺傳距離的分布頻率（圖2至圖5）
圖2 黑毛皮蠹的種內(nèi)、種間遺傳距離頻率分布
圖3 花斑皮蠹的種內(nèi)、種間遺傳距離頻率分布
圖4 赤擬谷盜的種內(nèi)、種間遺傳距離頻率分布
圖5 光肩星天牛的種內(nèi)、種間遺傳距離頻率分布
在遺傳距離頻率分布圖中，我們可以發(fā)現(xiàn)黑毛皮蠹等物種的種內(nèi)和種間的遺傳距離分布沒(méi)有交集（圖2），而花斑皮蠹、赤擬谷盜和光肩星天牛的遺傳距離分布出現(xiàn)了明顯的交集，也正是這些交集掩蓋了DNA barcoding gap（圖3、圖4、圖5）。
因此我們進(jìn)一步探尋其原因，發(fā)現(xiàn)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)表的數(shù)據(jù)中，HM398874.1_Trogoderma_parabile和HM398873.1_Trogoderma_parabile兩條數(shù)據(jù)與花斑皮蠹的條形碼數(shù)據(jù)遺傳距離差異極小，可能是該數(shù)據(jù)是花斑皮蠹被錯(cuò)誤的鑒定為斑皮蠹屬的另外一個(gè)物種Trogoderma parabile，也可能Trogoderma parabile和花斑皮蠹這兩個(gè)物種本身的COI基因差異很小，無(wú)法通過(guò)該條形碼區(qū)分這兩個(gè)物種；
KC440129.1_Tribolium_castaneum和JQ350711.1_Tribolium_castaneum與雜擬谷盜數(shù)據(jù)的遺傳距離差異極小，可能是該數(shù)據(jù)被錯(cuò)誤的鑒定為赤擬谷盜，從而掩蓋了DNA barcoding gap。
星天牛屬（Anoplophora）的數(shù)據(jù)情況較復(fù)雜，屬內(nèi)多個(gè)物種的種間遺傳距離小于0.1，從而出現(xiàn)了明顯的種間、種內(nèi)遺傳距離的交集，該屬內(nèi)共涉及12個(gè)物種，而這些物種相互之間均無(wú)法有效區(qū)分，即COI基因條形碼片段在星天牛屬的鑒定中很可能是無(wú)效的。這也解釋了我們?cè)谡頂?shù)據(jù)時(shí)發(fā)現(xiàn)的該屬COI基因條形碼片段較長(zhǎng)（70/90的片段超過(guò)900bp，而其他物種的有效條形碼數(shù)據(jù)為600bp或更少）的原因，學(xué)者們可能嘗試選用更長(zhǎng)的序列片段作為星天牛的DNA條形碼，以期更長(zhǎng)的片段能夠體現(xiàn)出更多的種間遺傳差異。
綜上，我們發(fā)現(xiàn)基于遺傳距離的DNA barcoding gap分析能有效界定6個(gè)檔案鞘翅目害蟲物種，星天牛屬的物種需要更多數(shù)據(jù)或者其他的方法才能進(jìn)一步界定，而使用條形碼數(shù)據(jù)時(shí)，原始數(shù)據(jù)鑒定的準(zhǔn)確性直接決定了DNA條形碼數(shù)據(jù)的效用，如果數(shù)據(jù)庫(kù)中存在過(guò)多的鑒定錯(cuò)誤的數(shù)據(jù)或者污染嚴(yán)重的不可靠數(shù)據(jù)，在利用數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)和遺傳距離分析時(shí)，會(huì)出現(xiàn)很大的誤差。
3.2 基于DNA條形碼的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建結(jié)果及分析
除了DNA barcoding gap的分析，我們還可以利用條形碼數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，通過(guò)序列間親緣關(guān)系的聚類分析來(lái)判斷樣本間的遺傳距離差異是否正確體現(xiàn)了其親緣關(guān)系，因此本項(xiàng)目利用510條COI基因條形碼數(shù)據(jù)作為內(nèi)群，用德國(guó)小蠊的同源COI基因片段做外群，在MEGA X軟件的Phylogeny模塊進(jìn)行了鄰接法（圖6）建樹(shù)，使用K-2P模型，自舉值設(shè)為500。
圖6 基于COI基因條形碼片段的檔案鞘翅目害蟲NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，NJ法可以界定本次研究取樣的絕大多數(shù)物種，即使星天牛屬的物種個(gè)別為復(fù)系，但是擁有三條以上數(shù)據(jù)的種都可以聚為單系，對(duì)于同屬的物種，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中無(wú)法有效構(gòu)建斑皮蠹屬和擬谷盜屬的單系性（非單系，即沒(méi)有完全聚類），這些屬內(nèi)部的物種分布在樹(shù)的不同位置，而并沒(méi)有聚為一支。系統(tǒng)發(fā)育分析能夠更好的區(qū)分一些種內(nèi)遺傳距離較大的物種，比如花斑皮蠹和赤擬谷盜，雖然二者所在的屬在樹(shù)圖中分布零散，但是兩個(gè)物種本身的單系性得到的穩(wěn)定的支持。
我們比較了基于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的界定方法和基于對(duì)比遺傳距離的界定方法，兩種方法均能有效的界定不同的物種，遺傳距離分析中種內(nèi)遺傳距離偏大而無(wú)法有效界定的物種，原因可能是標(biāo)本中存在其他形態(tài)相近的種或隱存種?；诮?shù)的分析比基于遺傳距離的界定更準(zhǔn)確，而基于遺傳距離的方法更加的簡(jiǎn)單高效，實(shí)際在評(píng)價(jià)某類群某種條形碼的適用性時(shí)，需要結(jié)合兩種方法進(jìn)行比較和借鑒。
以黑毛皮蠹的成、幼蟲COI基因條形碼為例，本項(xiàng)目采樣測(cè)序的成、幼蟲的COI基因條形碼序列與已公布的同物種條形碼序列比對(duì)時(shí)，在645bp的序列上僅出現(xiàn)了13個(gè)堿基的差異，其余的位點(diǎn)均完全一致，表明黑毛皮蠹不論是在成、幼蟲之間，還是在世界不同種群之間，都保持了很高程度的基因保守性。因此，利用COI基因作為條形碼序列，可以很高效的鑒別形態(tài)上難以辨認(rèn)的幼蟲、若蟲、蛹、甚至蟲體殘軀?；谕瑯拥脑?，DNA條形碼目前在食品行業(yè)中多用于鑒定食材來(lái)源，如魚翅、肉干等海鮮類產(chǎn)品和調(diào)理肉制品。
為了提高鑒定的精準(zhǔn)度，我們認(rèn)為可以增加測(cè)試片段，除了COI基因，還可以添加18S、28S等不同的基因 [17]，用多個(gè)片段建立數(shù)據(jù)集，其效果和在用形態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析中增添多個(gè)有效辨別特征一樣，分析結(jié)果會(huì)更可靠。當(dāng)測(cè)試片段足夠多的時(shí)候，可以找到不同種之間最有效的鑒定條形碼，確定實(shí)際檢測(cè)中利用不同的條形碼來(lái)界定物種。
通過(guò)本次研究，我們認(rèn)為DNA條形碼物種界定的技術(shù)應(yīng)該建立在物種信息準(zhǔn)確、片段數(shù)據(jù)詳實(shí)的數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上，然后通過(guò)分析樣本的條形碼數(shù)據(jù)找出樣本和數(shù)據(jù)庫(kù)分子數(shù)據(jù)上的異同，判斷分子數(shù)據(jù)的差異性和形態(tài)差異性是否一致，決定是否需要更多的分子片段才能完全體現(xiàn)出種間差異。對(duì)于形態(tài)上差距甚小的“隱存種”，或者鑒定形態(tài)不分明的正在進(jìn)化中的種，大量的分子數(shù)據(jù)可能比形態(tài)數(shù)據(jù)更有說(shuō)服力。對(duì)于形態(tài)上無(wú)法區(qū)分的樣本，可以先分析其分子數(shù)據(jù)，尤其對(duì)于分子數(shù)據(jù)差異較大的樣本，可建立更大的數(shù)據(jù)集做更深入的分析。
我們?cè)诜治鰯?shù)據(jù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一些分子數(shù)據(jù)種內(nèi)的差異較大，尤其是對(duì)于常見(jiàn)的、廣布的、基因交流頻繁的黑毛皮蠹、花斑皮蠹、煙草甲、赤擬谷盜等，這些常見(jiàn)的倉(cāng)儲(chǔ)物害蟲隨貨隨糧隨人傳播的可能性更大，不同的采集地點(diǎn)得到的同種的樣本很可能存在穩(wěn)定的遺傳差異，因此要注意這些物種的種內(nèi)遺傳差異，而對(duì)于毛皮蠹中亞種較多的物種，更需注意種下遺傳距離的區(qū)分。相反，如果COI基因片段不能體現(xiàn)某些物種間的差異或某些明顯的穩(wěn)定的形態(tài)差異（如本研究中的星天牛），一方面要考慮到同種異型的現(xiàn)象（如百怪皮蠹），另一方面也要考慮控制某形態(tài)差異的基因不是COI，有必要進(jìn)一步擴(kuò)增更多的片段進(jìn)行分析，若基因組數(shù)據(jù)無(wú)法得到結(jié)果，則可以進(jìn)一步考慮進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組甚至代謝組的分析，因?yàn)閯?dòng)物形態(tài)的變化有賴于其基因表達(dá)過(guò)程中轉(zhuǎn)錄的差異以及代謝過(guò)程的差異。
本文系財(cái)政部基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目“檔案庫(kù)房鞘翅目害蟲DNA條形碼鑒定”（2022-3J-01）的階段性研究成果。
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